2.3.7 TRANSPLANTE AL SUSTRATO

Sustratos de cultivo 

Un sustrato es todo material sólido distinto del suelo, natural, de síntesis o residual, mineral u orgánico, que, colocado en un contenedor, en forma pura o en mezcla, permite el anclaje del sistema radicular de la planta, desempeñando, por tanto, un papel de soporte para la planta. El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutrición mineral de la planta

También el sustrato la base de plántulas sanas. Un sustrato creciente de que es
limpio, libre de enfermedad y cuenta con espacios para el aire y el agua permitirá que la planta de semillero una oportunidad de crecer a su mejor potencial.


Tipo correcto de sustrato
Estructura con contenedores específicos. Una bandeja plana o de semillas requiere un sustrato más pesado; Considerando que, una bandeja con pequeñas células en crecimiento requiere un sustrato ligero. El sustrato debe estar bien equilibrado y contienen ingredientes que proveen materiales absorbentes para la celebración de agua y adecuada porosidad para espacios de aire de modo que las raíces tendrá oxígeno adecuado.

Las semillas necesitan la derecha, la cantidad de oxígeno y el agua antes de comenzar la germinación proceso. Las semillas empiezan mediante la absorción de agua, a continuación, enviar el radical que es el precursor de la raíz en el sustrato de crecimiento.

Los cotiledones abrir tan pronto como el radical entra en el creciente sustrato, proporcionando una fuente de nutrientes para el radical hasta que el radical tiene desarrollado en una raíz que es capaz de absorber agua y nutrientes.

2.3.6 CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE

Como sabemos normalmente las plantas que se encuentran en el medio natural están expuestas a los cambios fisiológicos del ambiente, y en algunos casos tarda su desarrollo, es por ello que las plantas in vitro contienen un medio M.S “controlado” en cuanto, a los cambios fisiológicos en que se encuentran.

Para realizar un trasplante de cultivo a sustrato se llevan acabo cambios fisiológicos tanto en la adaptación al medio ambiente, pues implica la humedad relativa en este caso es de 70%, esto lleva a la evaporación y transpiración de agua en la planta, función que realizan tanto en la epidermis, parénquima y estomas para la regulación del agua tanto entrada como salida; cuando se presenta calor y aire o viento seco es menos viable la adaptación de la planta al sustrato y principalmente al medio. La fotosíntesis, uno de los procesos mas importantes en la planta, tiene que estar estrictamente presente para la adaptación ya sea permanente o temporal de la plántula, pues implica funciones fisiológicas tanto en las raíces, hojas, tallos, yemas y demás partes de esta

2.3.5.4 HUMEDAD RELATIVA

ESTA DEPENDERÁ DEL FRASCO DONDE SE SEMBRÓ, POR LO REGULAR ANTES DE LA COLOCACIÓN DEL EXPLANTE QUEDA HUMEDAD Y DEBE E SER DEL 100 %

2.3.5.3 TEMPERATURA

EN EL CASO DE LOS CULTIVOS EN CONDICIONES CONTROLADAS REQUIERE UN RANGO DE 18 GRADOS A 25 ° c.

2.3.5.2 INTENSIDAD LUMINOSA

LAS PLANTAS IN VITRO NECESITAN DE 2000 A 2500 LUX CON LAMPARAS FLORECEN TES, Y EN CONDICIONES NATURALES NECESITAN DE 5000 A 8000 LUX, EN CONDICIONES NATURALES SI SE DEJAN EN LABORATORIO. 

2.3.5.1 FOTOPERIODO

Una pequeña observación es que elementalmente las plantas cultivadas in vitro no necesitaran tantas horas de luz; pero el mejor fotoperiodo en vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

Así, en los vegetales, la duración y la periodicidad en la iluminación tiene una influencia decisiva sobre la germinación y la duración del crecimiento vegetativo, así llegamos a la conclusión de que muchos fenómenos vinculados al desarrollo de las plantas pueden ser activado o no según las horas de luz que reciba.

2.3.5 CONDISIONES DE INCUBACION

Las condiciones de incubación engloba una serie de conceptos que por su mayoría son generales y se abarcan en todo sitio de laboratorio en medio de cultivo in vitro. Enseguida se hablara de unos conceptos generalizados de estas condiciones de incubación.

2.3.4.3 SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SOLIDOS Y LIQUIDOS

Los medios para la siembra aparte de los ingredientes para su desarrollo como son; nutrientes orgánicos, fuente de carbono, fuente de nitrógeno, vitaminas, reguladores de crecimiento etc. se agregan sustancias inertes solo para la posición y mejor desarrollo del explante. se agrega phytagel, o bien agar para solidificar lo. antiguamente se utilizaban medios líquidos como extractos o complejos orgánicos, como son el agua de coco, extracto de levadura etc. 

2.3.4.2 DISECCION DEL EXPLANTE

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado  al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

2.3 4.1 DESINFECCION DEL EXPLANTE

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo. Esto de hace con ipoclorito de sodio, alcohol en este caso al 90 % . 

2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE

Es el paso de tejidos vegetales en crecimiento ( EXPLANTES), ya cortados de la planta madre a un medio de crecimiento, donde tiene todas las condiciones para su desarrollo y crecimiento. 

2.3.3.3 TAMAÑO DEL EXPLANTE

Dependerá del tipo de planta a sembrar, pero las plantas preferiblemente son de crecimiento apical, axilar pequeño, pues así dependerá el corte del explante y la extracción desde la planta madre y sus ramificaciones, pues ocasionalmente no pasa de 4 cm. 

2.3.3.2 POSICION DEL EXPALNTE EN LA PLANTA

Los explantes pueden ser de cualquier posición de la planta siempre y cuando se lleve acabo la división celular y el crecimiento mas rápido del tejido vegetal, y libre de contaminantes, ya sea del tallo apical, ramas en crecimiento, yemas axilares, raíces, etc. 

2.3.3.1 TIPO DE EXPLANTE

Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo.

Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.


Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

2.3.3 EXPLANTE

Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento.Los ex plantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas.

2.3.2.5 EDAD DEL ORGANO O TEJIDO VEGETAL

La edad del tejido debe ser uno que sea un retoño joven con crecimiento y división celular joven, pues las células tienden a reproducirle mas rápidamente y servirá para el crecimiento continuo sin interrupción en los medios. pues la selección cuidadosa de esta técnica dependerá del buen manejo del laboratorista e investigador. 

2.3.2.4 CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA

La primera elección que debemos hacer es la de la variedad de planta que queremos cultivar y los rasgos concretos que buscamos en ella, como el vigor, la rapidez en el crecimiento, la producción de cogollos, la resistencia a enfermedades (sobre todo a hongos y mohos, la fuerza y el vigor de las ramas de nuestras plantas o la facilidad para enraizar que tienen estas ramas). 

Para ello las condiciones de la planta madre deben ser con buena protección de hongos y bacterias, así como de condiciones controladas en su desarrollo, pues servirán y serán patrones de siembra in vitro, pues todo esto dependerá el buen desarrollo de los próximos trabajos de siembra en laboratorio. 

2.3.2.3 EDAD DE LA PLANTA

La edad de la planta para la selección de la los ex plantes dependerá del desarrollo vegetativo y las condiciones de crecimiento. pues en plantas con alto indice de desarrollo de ramas, donde se lleva acabo el crecimiento apical y la división celular es muy importante, pues nos servirán para el manejo mas fácilmente y la obtención de los ramas pequeñas para sacar ex plantes y se puedan desarrollar mas rápidamente en el medio. 

2.3.2.2 FITOSANIDAD

También se puede dar una degeneración si las plantas madre están infectadas por algún virus o por alguna enfermedad u hongo. No usé nunca plantas enfermas, vegetadas o con estrés, ni ejemplares vulgares como plantas madre. Seleccionar solo aquellas plantas o esquejes sanos que muestren alguno de los rasgos antes mencionados.

Es importante que la planta madre de donde se obtendrán los ex plantes este libre de cualquier contaminante, ya sea de hongo, bacterias o enfermedades que puedan perjudicar al desarrollo de los ex plantes ya en el medio. 

2.3.2.1 GENOTIPO

El genotipo  es uno de los factores más influyentes en la regeneración in vitro ya que, existen grandes diferencias en la división celular y la capacidad regenerativa en plantas provenientes de una misma especie, como lo observa , quien considera que la respuesta morfogenética de los brotes regenerados, está fuertemente influenciada por el genotipo, ya que algunos explantes provenientes de diferentes individuos parentales presentaban una variación en su desarrollo con las mismas concentraciones hormonales.

2.3.2 SELECCIÓN DE LA PLANTA MADRE

La primera elección que debemos hacer es la de la variedad de planta que queremos cultivar y los rasgos concretos que buscamos en ella, como el vigor, la rapidez en el crecimiento, la producción de cogollos, la resistencia a enfermedades (sobre todo a hongos y mohos, la fuerza y el vigor de las ramas de nuestras plantas o la facilidad para enraizar que tienen estas ramas.

esto dependerá igual de la elección genotipo y fenotipo de la planta a elegir para la tolerancia y resistente a enfermedades. 

2.3.1.4 ADAPTACIÓN

Esta es la etapa de adaptación a campo, climatacion, o endurecimiento. De manera paulatina aumenta la cantidad de luz, se establece en viveros con mayas sombra, el proceso lleva un mes para la adaptacion. paulatinamente va aumentando la luz, disminuye la H.R, etc. 

2.3.1.3 ENRAIZAMIENTO

En esta etapa se lleva acabo la inducción de raíz de los ex plantes, pero dependerá de la colocación de cada uno de ellos en los medios MS. Para ello se establecieron en el medio reguladores de crecimiento y estimuladores de raíces y brotes como son; auxinas ( 2,4,D - A.I.A - A.I.B - A.N.A ). 

2.3.1.2 MULTIPLICACIÓN

En esta se da la multiplicación in vitro y se elige una cantidad exacta de masa para la regeneración de plantas necesarias para la siembra y desarrollo.En esta etapa se multiplican las partes vegetativas (es plantes) para aumentar la cantidad de brotes , para poder utilizarlos en la posterior multiplicación de producción. 

2.3.1 ESTABLECIMIENTO ASEPTICO

Este consiste en establecer los es plantes en los medios de cultivos, pero antes debe pasar por la desinfeccion de los es plantes para el buen desarrollo aseptico, pues se debe eliminar todo tipo de contaminantes y patogenos como hongos y bacterias que afecten el crecimiento y desarrollo de el es plante y pueda perderse la plántula . esto se hace con ipoclorito de sodio, alcohol al 96 % y 09 % , bromuro de metilo, dicloruro de mercurio. pero los mas utilizados y practicos en este caso es el de alcohol al 90 y 96 %. Despues de se siembra en una campana de flujo laminar, esta ayuda a que los microorganismos no entren y infecten los materiales utilizables en la siembra, de esta manera se establece la siembra aseptica. 

2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

ETAPA CERO: obtención de es plantes para la propagación  deben ser plantas muy cuidadas, sanas, sin hongos ni bacterias para un buen desarrollo de crecimiento en in vitro. ademas que sean de mucha importancia económica y ecología en el ámbito de la sociedad. ( ELECCIÓN DE LA PLANTA).

ETAPA UNO: se extraen los fragmentos a partir de los cuales se obtendrá los ex plantes. se desinfectan los fragmentos de la planta madre para eliminar los contaminantes externos que pueda traer la planta madre, asi como hongos o bacterias. asi igualmente se establecen en el medio de cultivo a desarrollarse. se desinfectan los explantes con cloralex y se siembra en una campana de flujo laminar, se hacen dos lavados con cloralex del ex plante y uno con agua por 5 minutos. ( ESTABLECIMIENTO).

ETAPA DOS: en esta se da la multiplicación in vitro y se elige una cantidad exacta de masa para la regeneración de plantas necesarias para la siembra y desarrollo. (MICRO PROPAGACIÓN).

ETAPA TRES: en esta etapa se lleva acabo la inducción de raíz de los ex plantes, pero dependerá de la colocación de cada uno de ellos en los medios MS. Para ello se establecieron en el medio reguladores de crecimiento y estimuladores de raíces y brotes como son; auxinas ( 2,4,D - A.I.A - A.I.B - A.N.A ). ( ENRAIZAMIENTO IN VITRO).

ETAPA CUATRO: Esta es la etapa de adaptación a campo, climatacion, o endurecimiento. De manera paulatina aumenta la cantidad de luz, se establece en viveros con mayas sombra, el proceso lleva un mes para la adaptacion. paulatinamente va aumentando la luz, disminuye la H.R, etc. (ADAPTACIÓN).

2.3 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas.

Este proceso se lleva acabo con una serie de pasos para que los cultivos ya sembrados en el material a desarrollar pueden crecer sin ningún inconveniente y asi lograr que la técnica sea de la mejor calidad posible al reproducir ex plantes de diferente plantas económicamente importantes para la sociedad y en peligro de algún patógeno u enfermedad que pueda desaparecer la. 

A continuación de mencionaran las etapas del establecimiento de cultivos vegetales para su desarrollo y adaptación correctamente. 

2.2.7 ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO

La esterilidad puede definirse como el conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar los microorganismos presentes en un objeto o sustancia.

Los métodos convencionales usados para la esterilización se pueden clasificar de acuerdo al agente y proceso esterilizan te en:

• Calor Húmedo 
• Calor seco 
• Químicos 
• Radiaciones
• Filtraciones 

El tiempo de exposición varia con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:

RECIPIENTE	VOLUMEN (ml)	TIEMPO DE EXPOSICIÓN (min)
VASO DE PRECIPITADO	20	12-14
ERLENMEYER	50	12-14
ERLENMEYER	200	12-15
ERLENMEYER	1000	20-25
ERLENMEYER	2000	30-35

Estos son los recipientes a utilizar en la esterilización y el tiempo de esterilización de acuerdo al volumen de cada medio de cultivo a esterilizar.

Como Cargar el Autoclave
a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).
b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. También facilita el secado.
c) Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.
d) Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.
e) La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba).

2.2.6 ESTERILIZACION DE MATERIAL DE CRISTALERIA Y OTRO MATERIALES

En este caso utilizamos únicamente el de calor húmedo, que fue de autoclave conde esterilizamos los medios de cultivos y los materiales a utilizar para la siembra de tejidos vegetales. pero hay varias formas de esterilizar materiales de cristalería y pinzas para la utilización en siembra. 

Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.
Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias líquidas).
La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

AUTOCLAVE
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.
Equipo
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.
La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.
Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave:
Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.
Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.

2.2.5 ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO

CALOR HÚMEDO:

El calor húmedo produce des naturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

1. El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua.

1. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Una esterilización segura con calor húmedo requiere temperaturas mayores a las del punto de ebullición del agua. Estas temperaturas son comúnmente alcanzadas por el vapor bajo presiones elevadas en un autoclave. Cuando la presión de un gas aumenta, la temperatura del gas aumenta proporcionalmente. Como el vapor de agua es un gas, aumentar su presión en un sistema cerrado aumenta su temperatura. Como las moléculas de agua están más energizadas, su penetración aumenta sustancialmente. Ocupar el autoclave es el método preferido para la esterilización, a menos que el material que se necesite esterilizar pueda ser dañado por el calor o la humedad. Un ejemplo de esto son algunos plástico que se pueden derretir o algunos objetos filosos los cuales pierden su filo.

La temperatura alcanzada en el autoclave son 121.5°C y una presión de 15 PSI, por lo tanto el tiempo requerido para la destrucción de la mayoría de las bacterias resistentes es aproximadamente 20 min. Para objetos más densos, serán requeridos más de 30 minutos, sin olvidar que las condiciones deben de ser controladas cuidadosamente para asegurar la correcta esterilización.

La mayor ventaja que posee este método de esterilización es que el tiempo de exposición de los materiales a esterilizar es mas corto que el calor seco.

Entre las ventajas de este método de esterilización tenemos que no deja residuos, los autoclaves modernos son sencillos de manejar y es un método rápido de esterilización. Éste es el método de elección para esterilizar materiales termo estables y no sensibles a la humedad como medios de cultivo, se puede esterilizar pinzas, vasos de precipitado, cajas petri, cu ter entre otros. 

2.2.4 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACION

El número de microorganismos: A mayor número de microorganismos que se tengan al inicio, mayor tiempo para eliminar la población entera.


Influencias ambientales: La presencia de materia orgánica regularmente inhibe la acción de antimicrobianos químicos. Microorganismos localizados en biopelículas, son difíciles de matar por biosidas, porque la actividad de éste es dependiente de la temperatura de la reacción química; los desinfectantes funcionan un poco mejor bajo temperaturas altas.


Tiempo de exposición: Los químicos antimicrobianos suelen requerir un mayor tiempo de exposición para microorganismos más resistentes o endoesporas, esto con el fin de que sea efectivo.


Características microbianas: Dependiendo las características del microorganismo se van a tener que usar diferentes métodos para poder eliminarlo.

Nivel de contaminación del objeto: presencia de materia orgánica y de microorganismos .Pueden alterar y condicionar el proceso de esterilización y derivar al fracaso del mismo. La presencia de proteínas protege a los microorganismos frente a la acción de los agentes esterilizan tes, específicamente los químicos.

Agua:Es importante verificar la calidad del agua para conseguir la máxima eficacia del detergente.

2.2.3 TIPOS DE ESTERILIZACION

2.2.2 DEFINICION

LA ESTERILIZACIÓN ES LA ELIMINACIÓN DE AGENTES PATÓGENOS POR MEDIO DE MÉTODOS FÍSICOS O QUÍMICOS  EN INSTRUMENTOS Y MEDIOS DE CULTIVO EN LA SIEMBRA DE TEJIDOS VEGETALES. 

2.2.1 GENERALIDADES

Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.

Procedimiento para la eliminación de microorganismos.

• Autoclave: aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión .

• Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.

• Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire.

• Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.

• Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire

2.2 ESTERILIZACION

Se le conoce como proceso de esterilización por medio del cual un material, superficie o sitio se libera de cualquier microorganismo o espora. Una vez ocurrido dicho proceso de determina a dicho sitio, material o superficie estéril o esterilizada. Los microbios se eliminan, inhiben o matan por medio de agentes físicos o agentes químicos, otros incluyen los agentes mecánicos.

Los métodos de esterilización comprenden entonces, todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos que se emplean para destruir gérmenes patógenos.
Los más utilizados en la actualidad son los métodos físicos (calor, radiaciones, filtración, centrifugación) y los métodos químicos (agente químico).

2.1.6 PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para determinar la cantidad de cada una de las soluciones stock que debían integrar el medio nutritivo a formular, se hicieron los cálculos necesarios. Estos cálculos consistieron en formular 250 ml de medio el cual se formuló a una concentración de 1x, para ello se multiplicaron las cantidades anteriores y fueron divididas entre la concentración (100x) de cada una de las 5 soluciones madre ya preparadas. 

V1               500 ml               V2: V1 C1/C2; V2: 500 ml x 1x / 50x

C1                 1x                    =10 ml de solución stock

Fue necesario realizar cálculos para adherir al medio azúcar y gelificante, para ello se hizo una regla de tres, donde se multiplico el volumen del medio a preparar (250ml), por 30g de sacarosa que corresponden a la solución en un litro de medio, por ello se buscó obtener la cantidad en gramos de azúcar, de tal forma que el resultado de la multiplicación fue dividido entre 1000ml, obteniendo así la cantidad de azúcar a pesar.

Phytagel           2.8 g/L                       2.8 g/L x 500 ml / 1000 ml= 1.4 g/500 ml
Sacarosa          30 g/L                        30 g/L x 500 ml / 1000 ml= 15 g/500 ml

Después de haber agregado las 5 soluciones stock en el matrazas. se agrega después la sacarosa agregando 100 ml de agua, con forme se agrega la sacarosa. Después aforar a 250 ml, después se regula el pH entre 5.6 y 5.8 utilizando HCL o KOH para subir o bajar el ph. después se agrega el Phytagel, se calienta a 40 °C, Aquí puede agregarse el Phytagel, se deja hervir por 2 minutos, después se saca y enfría poco a poco y se agrega a cada frasco con una cantidad a 20 ml.

2.1.5 PREPARACION Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

Son soluciones concentradas de nutrientes, son sales minerales que se emplean para un medio en particular algunos de estos se emplean en bajas concentraciones de acuerdo al mejor manejo en laboratorio y hace mas rápida la futura preparación de medios y posteriormente la siembra de tejidos vegetales.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES ( STOCK)

INTRODUCCIÓN

La célula vegetal para su metabolismo requiere elementos esenciales, los cuales le permiten completar su ciclo normal de vida; algunos los requieren en cantidades mayores, por lo que se llama macroelementos, ellos son: C, H, O, N, P, K, Ca, Mg y S; y los que requiere en menores cantidades, llamados microelementos; como son; Fe, Mn, Cu B, Mo, Zn, y Cl. En el cultivo de tejidos vegetales estos elementos se agrupan en compuestos orgánicos e inorgánicos con un grado de reactivo especifico, los cuales deben ser disueltos en agua. En ocasiones se requieren concentraciones muy bajas de alguno de ellos, por lo que es necesario preparar soluciones a una elevada concentración y a partir de esta diluirla hasta la concentración requerida. Para facilitar la preparación es necesario tener estándares de concentración conocida, soluciones madres. Existen varias formas de expresar la cantidad de los compuestos en una solución. Los principales son: porcentaje (%), molaridad (M) y partes por millón (PPM). Para que los tejidos establecidos in vitro respondan a la diferenciación (callo, organogénesis) se requiere que el medió de cultivo los contenga. Algunos de las presentaciones que contienen estos elementos son incompatibles químicamente (reaccionan entre si) y no se solubilizan, por lo que es necesario agruparlos por afinidad química. En esta practica realizaremos la preparación de las soluciones madre, patrón o estándar.

OBJETIVOS

· Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica.
· Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.
· Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.

MATERIALES
• Probeta graduada
• Matraz erlenmeyer
• Vaso de precipitado
• Micropipeta
• Pipeta
• Agua destilada
• Reactivos ya pesados

CALCULO DE LAS CONCENTRACIONES DE SULFATOS PARA PREPARAR EN 200 ML.

Reactivos
ü Mg SO4 . 7 H2O……370mg/l
ü Mn SO4 . 4 H2O……22.3mg/l
ü Zn SO4 . 7 H2O…….8.6mg/l
ü Cu SO4 . 5 H2O.……0.025mg/l

Operación para calcular el Mg SO4 . 7 H2O
1. - Mg SO4 . 7 H2O: (370 mg/L) (100x): 37,000mg/l
Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:
(37,000 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 7400mg/200ml
Ahora se debe convertir a (g):
(7400 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 7.4g/200ml

Operación para calcular Mn SO4 . 4 H20
1. - Mn SO4 . 4 H2O: (22.3 mg/L) (100x): 2230mg/l
Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:
(2230 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 446mg/200ml
Ahora se debe convertir a (g):
(446 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 0.446g/200ml

PESAJE DE LOS MATERIALES CALCULADOS.
Ya después de haber calculado se procedió a pesar las cantidades en la balanza analítica, se equilibro la balanza para el pesaje, se utilizo papel aluminio para verter los ingredientes cuando se esté pesando.

DISOLUCIÓN DE LOS INGREDIENTES PESADOS.

Los ingredientes se disolvieron por separado en un vaso de precipitado, el Cu SO4 . 5 H2O, debido a que no se calculo exactamente la cantidad deseada que era de 0.0005g, ya que se obtuvo 0.0064g, para obtener la concentración correcta el Cu SO4 . 5 H2O se disolvió en 10 ml de agua destilada, ya que se disolvió completamente, se hizo una regla de 3.
(0.0005g Cu SO4 . 5 H2O) (100ml) / (0.0064g Cu SO4 . 5 H2O): 0.781 mililitros

2.1.4.4 COMPLEJOS ORGANICOS

Compuestos organicos 

• Aminoácidos

• Poliaminas Su utilización es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrógeno en forma amina, producir procesos morfogénicos, etc. Suplementos de composición indefinida:

•  Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maíz, raíces y rizomas)

• Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, piña, tomate, patata, leche de coco.
•  Caseína hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composición precisa del extracto añadido, pueden resultar útiles sólo en casos concretos.
  
  
  Compuestos específicos:
  
  • Antioxidantes: ácido cítrico, ácido ascórbico
  
  • Adsorbentes: carbón activo
  
  • Controladores del potencial osmótico: polietilen-glicol, manitol Se puede precisar su aporte a los medios en condiciones concretas.

2.1.4.3 MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

Finalidad de Uso:

UNA excelente alternativa para el agar como agente gelificante para el soporte de la estructura de la siembra de tejidos vegetales. Phytagel permanece estáble mismo a altas temperatura . Phytagel pode resistir a autoclaves repetidas temperaturas y altas.

Los geles de agar se forman a concentraciones de menos del 1% de polisacárido, y son transparentes, duros y quebradizos. Esta última propiedad los diferencia de la mayoría de los otros geles de polisacáridos, que son más elásticos. Además tienen la propiedad particular de presentar una gran histéresis térmica. Es decir, mientras que el gel se forma (en el caso del agar de Gellidium) a una temperatura de alrededor de entre 30ºC, volver de nuevo a la disolución exige calentar el gel hasta entre 75ºC y 90ºC, según el tipo. Los geles de agar de Gracillaria presentan el mismo fenómenos, pero menos acusado. Con esta salvedad, los geles de agar son reversibles térmicamente.

es utilizado igual para el soporte de tejidos vegetales in vitro. es muy efectivo pero es muy difícil de conseguir y caro.

2.1.4.2 COMPUESTOS ORGANICOS

los macro nutrientes son los siguientes en la utilización de cultivos in vitro

VITAMINAS: Cuando las células de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina, ácido nicotítico, piridoxina, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, etc.

LOS AMINOÁCIDOS: representan para las células, una fuente efectiva e inmediata de nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico, aún cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio , sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es bastante discutido. Generalmente la inclusión de estos compuestos nitrogenados orgánicos es necesaria solamente cuando se inicia la formación de callo, se consideran como estimulantes o requeridos durante la proliferación celular . Tienen efecto notable sobre el desarrollo de tejidos vegetales cuando son usados en combinación, mientras que empleando uno solo no se muestra afecto.

Alguno tiene efecto antagónico entre ellos, así es el caso de la fenilalamina y tirosina , la leucina y valina, la isoleucina y valina , la arginina y lisina sobre el crecimiento de raíz del embrión de la avena bajo cultivo. En tejido de tabaco el efecto antagónico se observa con la isoleucina, valina y treonina. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina, ácido glutámico. hidroxiprolina, alanina, lisina, leucina, serina y cisteina.  señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. 

REGULADORES DE CRECIMIENTO: son los que iniben el crecimiento de las partes vegetativas. 

estos son:

• auxinas

• citocininas

• giberelinas

• acido absisico 

• etileno

las auxinas promueben el crecimiento en:

1. tallos                                                estas son AIA, ANA, 2,4,D

1. raices

1. dominancia apical 

las citocininas hace que las partes vegetales de las plantas crescan con mas facilidad.

Zea, Bap, 2,i P.

2.1.4.1 COMPUESTOS INORGANICOS

Se agrupan en Macro y Micro nutrientes :

MACRO NUTRIENTES

Los elementos requeridos en mayor cantidad, carbono , oxígeno e hidrógeno , aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos. 

Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones requeridas  y el amonio igualmente en milimoles, fósforo empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, el azufre como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad . Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation.

La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio y nitrato de calcio  y menos comúnmente como fosfato tricálcico, fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. 

MICRO NUTRIENTES

Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. 

El zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical. Cobre forma parte de enzimas oxidasas que están involucradas en la oxidación e hidroxidación de compuestos fenólicos, ácido abscísico y dopamina .El fierro y molibdeno juntos forman parte de la estructura de las enzimas nitrogenasa y nitrato reductasa .

El boro tiene su efecto más importante en inducir el crecimiento del tejido diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la deficiencia propicia una depresión de las citocininas lo que trae como consecuencia un incremento en la concentración endógena de las auxinas y de tal manera que en un sistema de raíz deficiente de boro. 

El cobalto se encuentra en la estructura de análogos de la vitamina B₁₂ que es involucrada en la síntesis de los ácidos nucleicos .

El fierro se usa como FeSO4 o FeCl2, pero en valores superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)2, tal como ocurre en el cultivo de raíz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro. En el cultivo de tejidos no se observó deficiencia de Fe, por lo que algunas sustancias, como quelatos pudieron penetrar en las células.

2.1.4 COMPONENETES DEL MEDIO DE CULTIVO

Componentes de un medio de cultivo:

• Sales inorgánicas
• Fuente de carbohidratos
• Reguladores de crecimiento
•  Aminoácidos
•  vitaminas
• Complejos orgánicos
• Reguladores de crecimiento vegetales
• Antioxidantes
•  Aguas
•  Material de soporte

2.1.3.2 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

La mayoría de los medios que se utilizan tienen el nombre dado por quien los formuló; Otros surgen de modificaciones sobre los medios genéricos, que son los mas conocidos. Entre los primeros podemos citar:

1. Knudson (1946): El primer medio conocido es el adecuado para de orquídeas. Bastante pobre en sales.

2. MS (Murashige y Skoog, 1962): Es el medio más conocido; se elaboró tomando el cultivo in vitro de tabaco como modelo y siguiendo un procedimiento cuantitativo se determinaron las concentraciones mas adecuadas de todos los nutrientes. Es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza por tener una elevada concentración salina.. En esos casos puede recurrirse a otros medios o simplemente utilizarlo diluido (1/2 MS, 1/4 MS).

3. White (1963): Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de uso complementario al MS. Se elaboró para cultivo de raíces de tomate.

4. B5 (Gamborg, 1970-1976): Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios, a los que dio diferentes números. EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.

5. WPM (Lloyd y McCown 1980):Se elaboró para el cultivo de tallos de plantas leñosas y arbustivas, tipos de plantas para las que está especialmente adaptado.

6. KM8p (Kao y Michayluk 1982): Kao y Michayluk abordaron la dificultad de lograr la viabilidad los protoplastos cultivados in vitro, hasta entonces muy limitada, desde el punto de vista de la optimización del medio, y formularon varios; el más exitoso fue el KM8p. Su característica principal y distintiva de los medios hasta entonces formulados es la gran diversidad de nutrientes que contiene, muchos de ellos no esenciales para el desarrollo de las plantas, pero que si han resultado limitantes en el cultivo de sus protoplastos.

TAREA: PREMIO NOBEL DE MEDICINA 2012

Premio Nobel de Medicina 2012: células madre pluripotenciales inducidas

Todos partimos de una única célula, el resultado de unir un óvulo y un espermatozoide. Está única célula se va multiplicando y generando células inmaduras que tienen la capacidad de producir todas las distintas células de un organismo, desde neuronas hasta las células de los huesos o la piel ( CÉLULAS MADRES PLURIPOTENCIALES). Se creía que el viaje era en una única dirección: de inmaduras a maduras. Los trabajos de John B. Gurdon y Shinya Yamanaka demostraron que la dirección opuesta también era posible: las células adultas pueden reprogramarse para convertirse en células inmaduras capaces de generar células de cualquier tejido.

John B. Gurdon en 1962 realizó un experimento determinante. Supuso con razón que en el genoma de una célula adulta sigue existiendo la información para convertirse en cualquier célula. En 2006 Shinya Yamanaka, trató de averiguar qué genes hacían que las células madre permanecieran inmaduras. Después de varios intentos encontró que solo 4 genes lo conseguían. Tomaron células del tejido conectivo, fibroblastos, e introdujeron en ellas los genes hallados. Al hacerlo habían reprogramado el fibroblasto maduro en una célula madre pluripotencial inducida. Ahora esta célula podía generar todo tipo de células como neuronas u otros fibroblastos. Una de las ventajas fundamentales de este trabajo es que no es necesario recurrir a embriones para lograr células madre, algo que plantea problemas éticos en determinados ámbitos. El descubrimiento les ha valido la concesión del Premio Nobel de Medicina y Fisiología de 2012.

OPINIÓN

Los cienteficos que realizaron esta investigacion dieron un paso importante para la medicina en este siglo ya que descubrieron de que las células adultas pueden reprogramarse para convertirse en células pluripotentes listas para desarrollar cualquier tipo de tejido del organismo. Lo que hicieron fue averiguar qué genes hacían que las células madre permanecieran inmaduras y encontraron los 4 genes que lo conseguían, esto supone un avance en este campo y para la humanidad entera ya que muchas enfermedades son degradantes a los organos del cuerpo y puede ayudar para su regeneracion. 

TAREA: TABLA VOLUMEN DE ESTERILIDAD / TIEMPO

La esterilidad puede definirse como el conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar los microorganismos presentes en un objeto o sustancia.

Los métodos convencionales usados para la esterilización se pueden clasificar de acuerdo al agente y proceso esterilizan te en:

• Calor Húmedo 
• Calor seco 
• Químicos 
• Radiaciones
• Filtraciones 

El tiempo de exposición varia con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:

RECIPIENTE	VOLUMEN (ml)	TIEMPO DE EXPOSICIÓN (min)
VASO DE PRECIPITADO	20	12-14
ERLENMEYER	50	12-14
ERLENMEYER	200	12-15
ERLENMEYER	1000	20-25
ERLENMEYER	2000	30-35

2.1.3.1 DEFINICION DE MEDIOS DE CULTIVO

Definición: Un medio de cultivo es una preparación o solución químicamente definida, donde un explante (con las condiciones de asepsia y cuidado necesario) expresa su potencial intrínseco, en condiciones favorables para su desarrollo y crecimiento. 

2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es una preparación o solución químicamente definida, donde un explante,con las condiciones de asepsia y cuidado necesario, expresa su potencial intrínseco.

Las plantas que crecen en la naturaleza tienen tres fuentes esenciales para su nutrición. Los nutrientes minerales los obtienen, junto con el agua, desde el suelo a través del sistema radical. El dióxido de carbono atmosférico es utilizado en el proceso de la fotosíntesis para proveer carbono como fuente básica de energía; por último, el cuerpo de la planta, utiliza los carbohidratos y nutrientes para sintetizar las vitaminas y sustancias de crecimiento esenciales para su crecimiento y desarrollo normal.

Los requerimientos para que un tejido vegetal crezca in vitro, en general, son similares a aquellos de las plantas intactas creciendo en la naturaleza. Sin embargo, en la mayoría de los casos sólo se cultivan tejidos aislados o una parte pequeña de los órganos de la planta; estos tejidos u órganos aislados carecen de la capacidad para sintetizar sus propios carbohidratos, la mayoría de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento vegetales. Por lo tanto, todas las sustancias que necesitaría una planta intacta en la naturaleza deben ser suministradas artificialmente a los tejidos cultivados.

El establecimiento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalmente esta determinado por la naturaleza del explante, por la composición del medio nutritivo, y varios factores ambientales 

TAREA: CINCO MEDIOS DE CULTIVO INDEFINIDOS

Se realizan a partir de extractos naturales, por tanto no se conoce exactamente cual es la composición del medio. Sin embargo presenta la ventaja de que ya están presentes todos o casi todos los elementos que una célula puede requerir. 

 ejemplos de estos medios son: 

• extractos de levadura 
• agua de coco
• caseina hidrolizada
• extracto de malta
• jugo de tomate y pepino
• Agar y jugo V8

2.1.2.2 EQUIPO DE LABORATORIO

Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar o campana de flujo laminar es un recinto que emplea un ventilador para forzar el paso de aire a través de un filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1 micras. Este tipo de equipos se fabrican en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo, que normalmente permanece limpia y estéril.

El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.

las  pesas que sirven para medir o cuantificar cualquier reactivo a utilizar con presicion en el laboratorio.

Las Parrilas sirve para calentar reactivos a materiales a utilizar en el laboratorio, son electricas conectadas a las corrientes del laboratorio y son faciles de manejar en cualquier espacio de las mezas del laboratorio.

El Refrigerador en laboratorio sirve con un compartimento principal en el que se mantiene una temperatura de entre 2 y 6 °C y también, frecuentemente, un compartimento extra utilizado para congelación a -18 °C y llamado, apropiadamente, congelador.

Las Mezas es un equipo que sirve para llevar acabo la realización de las practicas de investigación y cuenta con apartados especiales de manejo y buena comodidad, aguarda materiales y reactivos en sus cajones para el mas rápido manejo de estos y asi desarrollar las practicas.

BIBLIOGRAFIA 

http://antiguo.itson.mx/laboratorios/cienciasbiologicayalim.htm