3.5.2.3 CRYOCONSERVACION DEL GERMOPLASMA

 La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

3.5.2.2 SUPRESION DEL CRECIMIENTO

Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menos, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado.

3.5.2.1 FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO

Es bien conocido que las plantas necesitan de varios factores para su crecimiento y desarrollo. A continuación se enlistan algunos de ellos:

• Soporte. Proporcionado por el suelo, las piedras (plantas  litofíticas) u otras plantas (plantas epífitas neutralistas y parásitas).
• Agua. La cual es obtenida de la solución del suelo o directamente de la lluvia en el caso de las plantas epífitas, p. ej. las orquídeas y las bromelias
• Nutrimentos. Estos pueden dividirse en minerales (macro y microelementos), esenciales (carbono, hidrógeno y oxígeno); los primeros son tomados de la solución del suelo y los últimos del aire (por lo que también se les llama atmosféricos) y del agua.
• Aire. Este proporciona principalmente oxígeno para la respiración celular y CO2 (dióxido de carbono) para la síntesis de enlaces carbono-carbono  de los precursores de azúcares durante la fotosíntesis.
• Condiciones ambientales adecuadas. En el aspecto macroambiental requieren de cierta intensidad luminosa, fotoperíodo y temperatura, mientras que en el nivel microambiental necesitan rangos particulares de pH, de potencial redox, de intercambio iónico, así como de la interacción con seres vivos simbióticos, como los microorganismos

Por lo tanto, un medio de cultivo artificial debe proveer a la planta estos elementos en cantidad y calidad adecuadas. De esta forma, los medios nutritivos utilizados en cultivo de tejidos vegetales contienen: 

1. Sustancias nutritivas: sales minerales –macro y micronutrimentos; además una fuente de carbono (usualmente sacarosa) para soportar una tasa de crecimiento elevada y debido a que los tejidos vegetales  in vitro no cuentan con un sistema fotosintético bien desarrollado, es decir, son parcialmente heterótrofos.
2. Promotores del crecimiento: aminoácidos, vitaminas del complejo B y fitorreguladores (principalmente de tipo auxinas y citoquininas). La necesidad de agregar estos componentes se debe a que se manipula el crecimiento y desarrollo, y no basta con los promotores del crecimiento que las mismas células vegetales producen.
3. Soporte inerte: todos los componentes del medio de cultivo están disueltos en agua y generalmente contienen agar o agentes gelificantes sintéticos como el Phytagel® para formar un gel que sirve de soporte al tejido. Por supuesto también se cultivan tejidos vegetales en medios líquidos.
4. Otros ingredientes: se refiere a componentes opcionales –algunos complejos- como el agua de coco, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, carbón activado y sustancias naturales diversas.
5. Reguladores microambientales: el medio de cultivo debe ajustarse a un pH adecuado para la especie vegetal que se está cultivando. Lo usual es que sean ligeramente ácidos (5.5 a 6.5). También se debe ajustar el potencial redox en aquellas especies que tienen problemas de oxidación rápida, agregando sustancias como PVP, L-cisteína, ácidos orgánicos quelantes, carbón activado, etc. Para prevenir la precipitación de cationes (como el Fe++) se debe añadir un quelante como el EDTA.

3.5.2 METODOS DE CONSERVACION

Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ.

Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios.

Por otra parte, los métodos de conservación  ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo  in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos).

En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad.

A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.

3.5.1.3 ESTABILIDAD GENETICA

 La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El material recuperado de al conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos – o de ambas cosas (Withers, 1988).

En cultivos propagados vegetativamente se han aplicado criterios morfológicos para caracterizar los genotipos, diferencias que son difíciles de detectar en los cultivos propagados in vitro. Se ha señalado que la variación genética causada por un reajuste cromosómico puede presentarse en el cultivo de tejidos (D amato, 1964). Existe también una correlación entre el tiempo en que el material vegetal se cultiva como callo y la probabilidad de que ocurran en el cambios cromosómicos; esto podría causar un cambio hacia un tipo variante en la propagación in vitro (Schilde- Rentschler y Roca, 1987).  

3.5.1.2 VARIABILIDAD

La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de trasferencia se extiende durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que se haría al material conservado bajo nitrógeno liquido, por ejemplo, las características mas importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes /hojas muertas), numero de brotes verdes (para micropropagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.

3.5.1.1 REGENERACION

La regeneración de plantas enteras basada en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemas preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, que el proceso ofrece altas tasa de multiplicación y produce propagulos que poseen ejes de raíz y de yema (Stamp y henshaw, 1987). Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos mas estables (Evans et al., 1981). 

3.5.1 ASPECTOS IMPORTANTES EN LA CONSERVACION IN VITRO

Para algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semilla durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian complementarios para la conservación de genotipos específicos (cultivares, híbridos, clones elite) y para el traslado internacional de clones. Para otros cultivos de tubérculos y raíces tropicales y para especies de frutales como musa sp., que rara vez producen semilla y son practica mente estériles, el almacenamiento in vitro y los bancos genéticos ex situ en el campo estarían probablemente a la par. Por  ultimo, en las especies especies tropicales de semilla recalcitrante, la colección y el intercambio de materiales in vitro tendrán una función básica.

3.5 CONSERVACION IN VITRO

La conservación in vitro tiene que considerarse como parte dela estrategia general de conservación de una especie vegetal; es mas bien un auxiliar valioso y un suplemento de la conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro seria la única estrategia para conservar una especie dada.

3.4.3 FUSION DE PROTOPLASTOS

Celula vegetal deprovista de pared celular, por proceso mecanico o enzimatico, menbrana completamente expuesta, estado transitorio, permite manipulacion de esas celulas. 

3.4.2 VARIACIÓN SOMACLONAL

Esta plenamente comprobado que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981).

A diferencia de otros procesos de variación genética, se ha encontrado variación somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurre4ncia de mutaciones espontaneas, p. ej., es solo de una en un millón.

La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de mosaicos es mínima. En la mayor parte de los casos, por tanto, los somaclones pueden estabilizarse en una generación; las mutaciones, en cambio, requieren varias generaciones y retrocruces. La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos; los cambios genéticos que interfieren con la regeneración de las plantas-por ejemplo, un bloqueo en el metabolismo primario – no pasan por variación somaclonal a las plantas regeneradas.

La variación somaclonal puede causar una variación temporal (epigenetica) o una variación  genética. Por definición, los cambios epigeneticos no se trasmiten meioticamente, razón por la cual son útiles en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento si proviene de una verdadera modificación del material genético, ya que una variación celular puede provenir bien de una mutación, de un cambio epigenetico o de una combinación de ambos procesos (Meins, 1983).

Causas y manifestaciones.

Un buen número de revisiones recientes sobre la variación somaclonal han tratado aspectos de este tema como su ubicuidad, sus posibles causas, y su impacto potencial en el mejoramiento vegetal (Orton, 1984; Evans et al., 1984; Larkin et al). Es necesario entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genética durante el cultivo de tejidos, por razones de orden práctico. En primer lugar, la variación somaclonal es deseable para aumentar la ocurrencia de variabilidad en el mejoramiento de plantas; es además importante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos sea esencial, como en la micropropagacion rápida; es importante, en tercer lugar, para controlar el mecanismo que genera esa misma variación.

El origen de la variación no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. Puede ser, por ejemplo, un reordenamiento cromosómico, considerado el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse a un entrecruce (crossing over) somático, a un intercambio de cromatidas hermanas, a una alteración de los nucleótidos por metilación, a una perturbación de la replicación del ADN por culpa de un deposito de nucleótidos alterados, o también al silenciamiento o activación de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas.

En varias especies cultivadas se ha detectado variación somaclonal, y se ha demostrado el control genético de las mutaciones – mediante pruebas de trasmisión genética o análisis de ADN – solo en las siguientes: en tomate (color del fruto, resistencia a las enfermedades), en tabaco (color de la hoja, manchas en la hoja), en alfalfa (color de la flor), en papa (numero de copias del ADN mitocondrial), en trigo (patrón de la izoenzima ADH), y en arroz.

3.4 TECNICAS IN VITRO APLICADAS AL FITOMEJORAMIENTO

3.4.1  PRODUCCIÓN DE HAPLOIDES : CULTIVO DE ANTERAS Y ÓVULOS. 

Las metodologías disponibles para obtener cantidades considerables de haploides duplicados permitirán que el fitomejorador fije sistemas genéticos de gametos individuales, que sean reducidos y fáciles de evaluar en cualquier etapa del proceso de mejoramiento; se obtendrán así líneas homocigóticas sin pasar por el proceso de endogamia normal.

Los métodos mas ampliamente usados para la creación de haploides y de haploides duplicados se valen de la hibridación interespecifica o intergenerica, y del cultivo de esporas (masculinas o femeninas).

Los granos de polen de la papa silvestre (solanum phureja), p. ej. Contienen solo un núcleo generativo causado por una gametogénesis anormal; después de la hibridación interespecifica, con S. tuberosum como hembra, la fertilización doble no logra producirse, pero la célula del huevo de S. tuberosum es inducida a formar embriones partenogenicamente, y para ello estos serán haploides. Esta vía puede seguirse también en otras especies poliploides.

Diversas rutas hacia la obtención de la haploidia en plantas superiores, y su relación con la alteración de generaciones gametofiticas y esporofiticas. Los principales métodos para la obtención de heterofitos haploides emplean técnicas in vitro, como la androgénesis y la ginegenesis; otros procesos recurren a la partenogénesis y a la eliminación de cromosomas después de la hibridación interespecifica o intergenerica.

Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas haploides estériles pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta.

CONDICIONES QUE AFECTAN EL CULTIVO DE ANTERAS.

Genotipo de las plantas donantes.

El genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. Lam variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras se ha hallado entre especies y dentro de ellas, y se ha demostrado la heredabilidad de esta respuesta (Wenzel y Uhrig, 1981). Dicha capacidad para el cultivo de anteras es particularmente evidente en cultivares de arroz de los tipos Japónica e Indica de los cuales el primero es mas sensible que el ultimo así mismo, los genotipos invernales de B.napus dan una respuesta mas fuerte a ese cultivo que los tipos de primavera (Keller et al., 1987).

Además de la capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de plantitas (Wenzel et al., 1985; Lazar et al., 1984). Se demostró que ambos rasgos eran altamente heredables, lo que sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la selección.

Albinismo: Otro factor importante, especialmente en los cereales, es la ocurrencia de plantas albinas procedentes de polen. Estas plantas representan el 100% de algunas variedades de arroz; a menudo, pero no siempre, las variedades de arroz intensamente albinas se caracterizan también por una alta regeneración de la planta total (verdes más albinas). Sin embargo, esta correlación no vale para los híbridos.

Pretratamiento de las anteras.

El tratamiento de las anteras con temperatura baja o alta, con choque osmótico, o con otros estímulos tiende a aumentar la producción de plantitas de polen. El tratamiento de las anteras, o de las panículas, de arroz con 35 C durante 10 a 15 minutos, seguido por un periodo de 8 días a 10 C, aumenta la respuesta al cultivo de anteras; un efecto similar, no obstante, se obtiene con un tratamiento de 10 C durante 8 días solamente. El tratamiento de frio se ha relacionado con una disminución en el albinismo de los cereales, así como con la estimulación de la división mitótica ecuacional de las microesporas androgeneticas (Ouyang, 1986).

3.3.7 APLICACIÓN AGRONOMICA

Las ventajas y aplicaciones en la agronomia pùeden ser estas: 

• Plantas libres de virus
• intercambio y almacenamiento de germoplasma
• transferencias de genes 
• cultivos de importacia economica

3.3.6 FACTORES QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA POSIBILIDAD DE OBTENER PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS

Hay varios factores que influyen en la obtención de plantas sanas por MICROINJERTO: 

El tipo de patógeno es muy importante. Las bacterias endógenas, fitoplasmas y micoplasmas son muy fáciles de eliminar, debido a que su gran tamaño relativo hace difícil que puedan infectar las células de los ápices. La eliminación de virus y viroides es más difícil, pero existe una gran variabilidad en los resultados. Algunos son muy fáciles de eliminar y prácticamente el 100% de las plantas obtenidas están sanas, pero otros son muy difíciles y sólo se eliminan de un pequeño porcentaje de las plantas obtenidas. Probablemente estas diferencias están relacionadas con la mayor o menor facilidad de estos patógenos de moverse de célula a célula en los tejidos del huésped. Este factor es también probablemente responsable de que un mismo patógeno sea más fácil de eliminar en unos clones que en otros de una misma especie.

Las c o n d i c i o n e s óptimas de cultivo que favorezcan la formación de brotes vigorosos favorecen la eliminación de patógenos. La temperatura de cultivo de las plantas es muy importante. El cultivo de las plantas infectadas a temperaturas altas dificulta la replicación y movimiento de los patógenos termosensibles, por lo que se facilita su eliminación. Temperaturas de 30-32∞C durante 2-3 semanas pueden ser suficientes para incrementar de forma muy importante la incidencia de eliminación de algunos patógenos, e incluso tratamientos de termoterapia seguidos de cultivo o microinjerto de ápices se utilizan rutinariamente en algunos programas.

El tamaño del ápice juega un papel importante en la eliminación de pató-genos. El aumento de tamaño incrementa el porcentaje de regeneración y de prendimiento, pero reduce la proporción de plantas sanas obtenidas. En consecuencia, es necesario en cada caso adoptar una solución de compromiso que permita obtener unos resultados aceptables en ambos parámetros El costo, el tiempo requerido y la dificultad de las técnicas de cultivo  in vitro y de diagnóstico de patógenos son los aspectos que deben considerarse para la decisión del tamaño de ápice a utilizar en los programas rutinarios. Por ejemplo, para el saneamiento de cítricos por microinjerto se recomienda la utilización de un ápice compuesto por el meristemo apical y tres primordios foliares, con una longitud de 0'1 a 0'2 mm. Con este tamaño se puede obtener alrededor de un 50% de prendimiento y más del 90% de eliminación de patógenos.

3.3.5 MICROINJERTO

Es una tecnica utilizada en ensayos de revigorizacion, orientados principalmente a la clonacion de materiales adultos seleccionados libres de contaminacion. El material vegetal adulto es propagado vegetativamente in vitro, cultivado en un medio MS con reguladores de crecimiento. 

Para la preparacion del patron se siembra en tubos de ensayo con medio de germinacion compuesta por sales minerales salificando el agar, donde permanece en oscuridad constante a 27 - 30 º C durante alrededor de dos semanas hasta q las plantulas alcansen su desarrollo optimo para su microinjerto. 

Para la propagación del injerto es recomendable utilizar injertos menores de 5 cm para evitar su degradacion. a este se le realiza la esterilizacion en hipoclorito de sodio y twen durante cinco minutos.

3.3.4 CULTIVO DE EMBRIONES

 El cultivo de embriones ha ayudado al mejoramiento genético de especies arbóreas por que acorta el periodo siembra-floración; los embriones cultivados in vitro no necesitan un periodo de latencia anterior a la germinación. Asimismo, ha sido efectico para acortar el ciclo de mejoramiento de Iris spp., por que acorta el periodo de latencia de las semillas que oscila entre unos pocos meses y varios años; esta latencia se debe a algunos inhibidores del crecimiento del embrión presentes en el endospermo y en la cubierta de la semilla. Por medio del cultivo de embriones, es posible acortar la latencia y producir plántulas para el trasplante a las 2 o 3 semanas.

FACTORES QUE AFECTA EL CULTIVO

1.  Medio de cultivo. Por ejemplo, la concentración optima de sacarosa para el crecimiento de embriones en forma de corazón es de 120 g/litro, los niveles altos de sacarosa previenen la germinación precoz y proveen una fuente de carbohidratos mejor que otros azucares.

• 
  
•  Osmolaridad. El medio de cultivo, que contiene una concentración alta de sacarosa, está ubicada en el centro del recipiente de cultivo y rodeada a su vez de otro medio que contiene una concentración más baja de sacarosa. Después de un tiempo, la osmolaridad en la parte central del recipiente de cultivo se reduce debido a la difusión de agua desde el medio que lo rodea.

3.3.3 CULTIVO DE APICES MERISTEMATICO

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados vegetativamente, contiene virus sistemáticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarias otros métodos.

3.3.2 CULTIVO DE MERISTEMOS APICALES

El meristemo apical (con un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas

El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes, es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de enorme potencial: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4 millones de claveles en un año.

La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.  

Fases del cultivo de meristemos

1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

2. Siembra en el medio del tubo.

3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.

4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).

5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc..

6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.

7. Plantación en el campo.

3.3.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA

Actualmente la alternativa de más éxito es el cultivo de meristemas apicales, frecuentemente combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos métodos son usados, las plantas no solo son liberadas del virus,sino también de hongos y otros patógenos.

El primer cultivo con resultados satisfactorios fue el de Morel y Martín (1952), quienes cultivaron ápices de dalias infectadas con virus y lograron obtener plantas sana. Morel (1955) realizó un cultivo meristemático con Cymbidium, Cattleya y Phajus, obteniendo orquídeas libres de virus, y en 1960 reporta que es necesario hacer ciertas modificaciones en el medio, ya que géneros como Vlanda y Phalaenosis no responden favorablemente (citado por Lecoufle, 1969).

Existen otras investigaciones en plantas ornamentales, pero solo se han mencionado las más importantes, por los aportes que han brindado en este campo.

En cuanto a especies hortícolas y frutales se han realizado importantes investigaciones en relación con la obtención de material sano a partir de meristemos apicales; los más relevantes fueron hechos en papa (Sussex, 1963; Ingram y Robertson, 1965; Accatino, 1966; Gregorini y Lorenzi, 1964; Mellor y Stace – Smith, 1977; Wang, 1977 y Solórzano, 1983), chile (Juo, Wahg y Chien, 1973), fresa (Belkengren y Muller, 1962), manzano (Elliott 1972; Jones, 1976; Aboot, 1976; Jones y Hopgood, 1979), vid (Barlass y Skene, 1978), etc.

4. Termoterapia.

Consiste en la aplicación de altas temperaturas a las plantas completas o partes aisladas:

Algunos virus son más estables que otros, y esto causa diversos problemas en su erradicación, por lo que necesitan periodos más largos para unos y más cortos para otros, con diferentes tratamientos. Algunas especies son dañadas por las altas temperaturas continuas, por lo que se recomienda una alternancia de temperaturas altas y bajas, disminuyéndose así los daños causados en los tejidos de las plantas.

5. Quimioterapia.

Es la aplicación de productos químicos al medio de cultivo, lo que ocasiona una mayor probabilidad de obtener plantas de patógenos, por lo que al aplicarse diferentes productos quimioterapéuticos de manera exógena al medio de cultivo, estamos asegurando la obtención de material sano.

En el cultivo de ápices de papa (Solanum tuberosum L.) se aplicó verde de malaquita como agente quimioterapéutico, observándose en los resultados un mayor número de plantas libres de virus "X" (Norris, 1954; Oshima y Livingstone, 1961) obtuvo resultados semejantes al incluir en el medio 2, 4 – D, obteniendo una mayor frecuencia de plantas sanas.

Johnstone y Wade (1974) sugieren que al aplicar altas concentraciones de citoquininas y auxinas estás actúan favoreciendo o estimulando el crecimiento activo del hospedero, pero no el de la partícula viral. No hay muchas evidencias al respecto, pero se dice que los reguladores del crecimiento reducen la concentración del virus pero no lo erradican (Gohen y Walkey, 1978).

Estudios quimioterapéuticos más recientes sugieren que incorporando al medio de cultivo metabolitos químicos como el Kibavirin (virazole), que es un producto antiviral, se puede erradicar el virus (Mough, 1976).

Combinando la quimioterapia con el cultivo de meristemos de tabaco infectado con virus "X" de la papa se logró una erradicación total del mismo (Sherpard, 1977); más recientemente ha sido incorporado el vizarole aa concentraciones de 50 y 100 mg/l, encontrándose que erradicó el CMV de tejido meristemático de Nicotiana rustica.

Como se puede observar, los avances obtenidos en la técnica de cultivo de meristemos, auxiliada con la aplicación de termoterapia y quimioterapia, ha tenido grandes logros en cuento a la aplicación de las técnicas a diferentes especies.

Cabe mencionar que en los países desarrollados, en los últimos años, se han establecido compañías que se dedican a propagar de una manera comercial diferentes especies, que incluyen hortalizas, cultivos básicos, frutales, especies forestales, plantas medicinales, etc.

En la página siguiente se muestra un esquema representativo de cómo se debe llevar a cabo un programa de producción de plantas libres de virus a nivel comercial.

3.3 PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados vegetativamente, contiene virus sistemáticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarias otros métodos.

3.2.4 APLICACION AGRONOMICA

Las ventajas de este método es que permite obtener muchos individuos iguales en una pequeña superficie, controlar las condiciones ambientales, estudiar diversos procesos de las plantas y evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados). Constituye uno de los métodos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

También se utilizan para:

• micro propagación en gran escala
• fito sanidad
• metabolismos secundarios
• mejoramiento. 

3.2.3 RUTAS: ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA

ORGANOGENESIS: creación de órganos vegetales in vitro: raíces, tallos, hojas, meristemos, flores, microtuberculizacion. ( división multicelular) puede ser directa o indirecta. 

DIRECTA: se generan órganos directamente sobre el explante. 

INDIRECTA: el ex plante pasa por una etapa intermedia llamada callo y despues se forman los órganos. 

EMBRIOGENESIS: es la formación de embriones (somáticos) sin que aya unión de gametos. ( ovulo y polen). origen en una sola célula. el embrion es bipolar ( forma raíces y tallos). 

DIRECTA: cuando se forman embriones directamente.

INDIRECTA: se forman después de un callo ( es la mas común). despues de la formacion del callo embriogenico. 

3.2.2 TEJIDOS EMPLEADOS

Los diferentes tejidos empleados para el cultivo in vitro son los siguientes:

• Cultivo de suspensión de células vegetales
• cultivo de segmentos nodales
• cultivo de semillas
• cultivo de anteras
• cultivo de meristemos 
• cultivo de raíces, hojas, tallo, cambium.
• cultivo de embriones
• cultivo de ápices
• cultivo de partes vegetativas ( tubérculos, rizomas, bulbos, estolones)
• cultivo de protoplastos. 

TAREA: APICES MERISTEMATICOS CULTIVADOS IN VITRO

La regeneración de plantas sanas partiendo del cultivo in vitro de ápices meristematicos de ciertos vegetales leñosos exige la búsqueda de técnicas complejas y su empleo acertado. esta técnica debe permitir al explante sortear frecuentes dificultades como la oxidación, la heterogeneidad de respuesta, la reversión al estado juvenil, la presencia de inhibido res de enrizamiento y, sobre todo, la sobre vivencia al trasplante en condiciones autotrofas.

Murashige y Navarro plantearon la posibilidad del micro injerto in vitro de apices sobre plantulas provenientes de semillas, logrando así el desarrollo de plantas libres de numerosos virus.

3.2.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA

Es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.Se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por la Ingeniería Genética, Mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

El objetivo de cultivas plantas in vitro puede ser, por ejemplo, propagar masivamente plantas en vías de extinción, o plantas difíciles de propagar por otros métodos, o para clonar (copiar) individuos que tienen características agronómicas deseables (mejores frutos, resistentes a las sequías, etc.), para obtener plantas libres de virus, para conservar la diversidad genética de una población, entre otras aplicaciones.

La reproducción de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que las células vegetales son totipotenciales. Esto significa que las células vegetales poseen la capacidad de desarrollar un nuevo individuo completo, sin que sea necesaria la unión de células sexuales. Es decir que a partir de unas pocas células, se puede obtener un organismo completo, de forma asexual.

3.2 MICROPROPAGACION VEGETAL

Es la propagación clonal o masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. ( se realiza en condiciones asepticas, en un medio sintético nutritivo, con control de temperatura luz y foto periodo).

3.1 GENERALIDADES

El cultivo en medio nutritivo, bajo condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, ex plantes, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores.

El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir "dentro de vidrio", es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero también de células y tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. En las siguientes secciones nos referiremos siempre al cultivo in vitro aplicado a las plantas, omitiendo otros usos de esa técnica.

Las técnicas que se utilizan para la propagación de plantas in vitro son: 

. cultivo de suspensión de células vegetales

. cultivo de segmentos nodales

. cultivo de semillas

. cultivo de anteras

. cultivo de meristemos

. cultivo de raíces, hojas, tallos, cambium

. cultivo de embriones

. cultivo de ápices

. cultivo de partes vegetales

. cultivo de protoplastos 

los tejidos vegetales se llevan acabo con la finalidad de:

• La micro propagación 
• fito sanidad
• metabolitos secundarios(flores, hojas)
• mejoramiento (embriones) 

Existen 3 teorías para el cultivo de tejidos vegetales:

a) TOPIPOTENCIALIDAD CELULAR: Es la regeneración de una planta apartir de una célula vegetal mediante cultivo in vitro.  

b) DESDIFERENCIACION: Transformación y perdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristematico. 

c) REDIFERENCIACION: Cuando los meristemos se convierten en tejido especializados. ( para que esto suceda se necesita auxinas/ citocininas).  

UNIDAD 3