4.4 BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA

 

El uso desde hace muchos años de proteínas recombinan tes ha tenido gran impacto en la elaboración de alimentos, como las enzimas quimosina, en la producción de quesos, amilasas en la producción de jarabe, pectinasas, para la elaboración de jugos, glucosa oxidasas y catalasas para la deshidratacion de huevo, lipoasa para fabricacion de aceites de pescado etc. 

4.3 LEGISLACION

BIOSEGURIDAD 

En el contexto de protocolo de Carta Agena y del proyecto de ley de Bioseguridad se refiere al : 

Conjunto de lineamientos, medidas y acciones de prevención, control, mitigacion, y remediador del impacto y repercusiones ambientales adversos de los organismos  geneticamente modificados. 

Organismos geneticamente modificados: Cualquier organismo que posee una combinación nueva de material genético que se aya obtenido mediante la aplicación de la biotecnologia moderna.

4.2.5.2 ANIMALES TRANSGENICOS

Los animales transgénicos son aquellos que poseen un gen que no les pertenece La forma más sencilla para generar un animal transgénico es la que involucra el aislamiento del gen que se quiere introducir (al que llamaremos transgén), su clonación y manipulación para que pueda ser expresado por el organismo blanco, y su inserción en el organismo. Para lograr que todas las células del organismo expresen este nuevo gen, incorporamos dicho gen en un embrión en estadio de cigoto. Una vez seguros que el embrión incorporó el transgén, implantamos el embrión en un animal receptivo, que actúa como madre (en un procedimiento similar al de fertilización in vitro).

obtención de órganos animales (cerdos) con genes humanos para no ser rechazados en transplantes.

animales con carnes y huevos con menos colesterol y grasas

 pollos sin plumas

4.2.5.1 PLANTAS TRANSGENICAS

Son productos de origen animal o vegetal obtenidos a partir de individuos cuya información genética ha sido manipulada por el hombre a fin de modificar alguna de sus características gracias a que poseen determinados genes introducidos por el hombre mediante ingeniería genética; así por ejemplo existen variedades de cereales que soportan plagas y sequías, frutos que tardan más en madurar o en pudrirse, animales con órganos de características parecidas a los humanos, etc.

Para sus defensores representan el final de algunos problemas de la humanidad, como son la carencia de órganos para transplantes o la erradicación del hambre en el mundo, para sus detractores suponen un riesgo para la salud humana no calculado, por el hecho de que acumulan insecticidas, pierden sus cualidades nutritivas, o pueden transmitir al hombre enfermedades de otros seres vivos.

resistentes a insectos: maíz y algodón con un gen que produce una toxina para orugas y escarabajos

- a herbicidas: soja, algodón, maíz, resisten a altas concentraciones de herbicidas que se echan en los campos para erradicar malas hierbas

- a condiciones ambientales: frío, sequía, alta salinidad, etc.

CULTIVOS TRANSGÉNICOS
Alfalfa Espárrago Maíz Soja
Algodón Fresa Manzana Tabaco
Arroz Girasol Melón Tomate
Berenjena Guisante Patata Trigo
Centeno Lechuga Pepino Uva
Ciruela Lino Pimiento Zanahoria

4.2.5 TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE EN LA AGRICULTURA

Se a modificado genéticamente, a lo largo de cientos de años, las especies que utilizamos para alimentación, y hasta hace poco sin conocer la estructura del ADN, utilizando mutágenos que se sabe generan múltiples cambios en los genomas de los organismos. Sin embargo, estas técnicas originales de mutagénesis y los organismos generados, no se cuestionan como los transgénicos, cuando en el fondo hoy sabemos que los métodos usados previamente generan cambios mucho más amplios en el genoma de estos organismos. La razón de la falta de cuestionamiento es, probablemente, la ausencia de daño por estos organismos altamente modificados, desde el punto de vista genético.

4.2.4 VECTORES DE CLONACION

Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora.

Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6).

los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb.

 

4.2.3 CLONACION DE GENES

     Es el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo. Otra alternativa es la de crear un conjunto de todas las secuencias de ADN expresadas en una célula específica mediante la producción de copias complementarias de ADN a partir del ARNm hallado en dichas células (v ase Biología molecular). En ambos casos, los fragmentos de ADN se unen a un vector, un virus bacteriano conocido como bacteriófago o a un ADN circular denominado plasmido, que se introduce en una bacteria de forma que cada una adquiere solo una copia del vector y por tanto recibe solo un fragmento de ADN.

Clonación de genes

La clonación de genes es una técnica mediante la cual se selecciona un gen que interesa por alguna razón, generalmente porque produce alguna proteína de interés para el hombre (antibióticos, vacunas, proteínas terapéuticas, hormonas, etc.), se introduce en una célula sencilla, normalmente bacteriana o de algún protista sencillo, como las levaduras, y se hace que esa célula se divida muchas veces y que fabrique la proteína que nos interesa; luego se purifica la proteína y se puede distribuir para su uso. Las fases del proceso son las siguientes:

* Obtener del fragmento de ADN que contiene el gen que se quiere clonar

* Insertar dicho gen en otra molécula de ADN que sirva de transportador (vector), generalmente ADN de virus y bacterias

* Introducir el vector de clonación con el gen que nos interesa en una célula de otro organismo (célula hospedadora); la célula hospedadora suele ser una célula bacteriana por su sencillez y rapidez de multiplicación

* Multiplicar la célula hospedadora para obtener muchas copias del gen

Hoy en día existe una técnica para clonar genes que es la PCR (Polymerase Chain Reaction), en la que a partir de un fragmento de ADN cualquiera, se obtienen muchas copias por la acción de la enzima ADN polimerasa, responsable de la replicación del ADN.

4.2.2 ENZIMAS DE UNION

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.

Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.

4.2.1 ENZIMAS DE CORTE

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichia coli
EcoRII	Escherichia coli
HindII	Haemophilus influenzae
HindII	Haemophilus influenzae
HaeIII	Haemophilus aegyptius
HpaII	Haemophilus parainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratia marcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillus globiggi

Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998).

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.

De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:

-las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombínate.

-Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.

-Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.

 Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.

Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.

4.2 CORTE Y UNION DE MOLECULAS DE ADN

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado.

Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de Haemophilus aegyptius.

Una característica de las enzimas de restricción es el reconocimiento de secuencias palindromicas.

4.1 TRANSFORMACION DE ORGANISMOS

El principio de la tecnología de DNA recombínate se basa en la inserción de un fragmento de DNA foráneo en un hospedero de clonaje molecular  por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido. Una vez que el fragmento de DNA foráneo se ha introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje molecular y la recombinación, dando como resultado la expresión del gen o los genes introducidos en un organismo diferente.

En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.

 La ingeniería genética en plantas también ha provisto la mejora de ciertas especies haciéndolas más resistentes o introduciendo ciertas características de otros individuos para mejorarlas.

En la manipulan de moléculas de ADN uniendo segmentos de ADN en un lugar fuera de la célula u organismo, para luego introducirlas en una célula y hacerlas replicarse allí, por si mismas o después de a ver integrado en un cromosoma celular. 

proviene de de la unión artificial de dos fragmentos de ADN, de esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria u hongo) produzca una proteína que le sea totalmente extraña. 

UNIDAD IV DNA RECOMBINANTE

3.5.2.3 CRYOCONSERVACION DEL GERMOPLASMA

 La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

3.5.2.2 SUPRESION DEL CRECIMIENTO

Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menos, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado.

3.5.2.1 FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO

Es bien conocido que las plantas necesitan de varios factores para su crecimiento y desarrollo. A continuación se enlistan algunos de ellos:

• Soporte. Proporcionado por el suelo, las piedras (plantas  litofíticas) u otras plantas (plantas epífitas neutralistas y parásitas).
• Agua. La cual es obtenida de la solución del suelo o directamente de la lluvia en el caso de las plantas epífitas, p. ej. las orquídeas y las bromelias
• Nutrimentos. Estos pueden dividirse en minerales (macro y microelementos), esenciales (carbono, hidrógeno y oxígeno); los primeros son tomados de la solución del suelo y los últimos del aire (por lo que también se les llama atmosféricos) y del agua.
• Aire. Este proporciona principalmente oxígeno para la respiración celular y CO2 (dióxido de carbono) para la síntesis de enlaces carbono-carbono  de los precursores de azúcares durante la fotosíntesis.
• Condiciones ambientales adecuadas. En el aspecto macroambiental requieren de cierta intensidad luminosa, fotoperíodo y temperatura, mientras que en el nivel microambiental necesitan rangos particulares de pH, de potencial redox, de intercambio iónico, así como de la interacción con seres vivos simbióticos, como los microorganismos

Por lo tanto, un medio de cultivo artificial debe proveer a la planta estos elementos en cantidad y calidad adecuadas. De esta forma, los medios nutritivos utilizados en cultivo de tejidos vegetales contienen: 

1. Sustancias nutritivas: sales minerales –macro y micronutrimentos; además una fuente de carbono (usualmente sacarosa) para soportar una tasa de crecimiento elevada y debido a que los tejidos vegetales  in vitro no cuentan con un sistema fotosintético bien desarrollado, es decir, son parcialmente heterótrofos.
2. Promotores del crecimiento: aminoácidos, vitaminas del complejo B y fitorreguladores (principalmente de tipo auxinas y citoquininas). La necesidad de agregar estos componentes se debe a que se manipula el crecimiento y desarrollo, y no basta con los promotores del crecimiento que las mismas células vegetales producen.
3. Soporte inerte: todos los componentes del medio de cultivo están disueltos en agua y generalmente contienen agar o agentes gelificantes sintéticos como el Phytagel® para formar un gel que sirve de soporte al tejido. Por supuesto también se cultivan tejidos vegetales en medios líquidos.
4. Otros ingredientes: se refiere a componentes opcionales –algunos complejos- como el agua de coco, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, carbón activado y sustancias naturales diversas.
5. Reguladores microambientales: el medio de cultivo debe ajustarse a un pH adecuado para la especie vegetal que se está cultivando. Lo usual es que sean ligeramente ácidos (5.5 a 6.5). También se debe ajustar el potencial redox en aquellas especies que tienen problemas de oxidación rápida, agregando sustancias como PVP, L-cisteína, ácidos orgánicos quelantes, carbón activado, etc. Para prevenir la precipitación de cationes (como el Fe++) se debe añadir un quelante como el EDTA.

3.5.2 METODOS DE CONSERVACION

Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ.

Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios.

Por otra parte, los métodos de conservación  ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo  in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos).

En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad.

A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.

3.5.1.3 ESTABILIDAD GENETICA

 La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El material recuperado de al conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos – o de ambas cosas (Withers, 1988).

En cultivos propagados vegetativamente se han aplicado criterios morfológicos para caracterizar los genotipos, diferencias que son difíciles de detectar en los cultivos propagados in vitro. Se ha señalado que la variación genética causada por un reajuste cromosómico puede presentarse en el cultivo de tejidos (D amato, 1964). Existe también una correlación entre el tiempo en que el material vegetal se cultiva como callo y la probabilidad de que ocurran en el cambios cromosómicos; esto podría causar un cambio hacia un tipo variante en la propagación in vitro (Schilde- Rentschler y Roca, 1987).  

3.5.1.2 VARIABILIDAD

La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de trasferencia se extiende durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que se haría al material conservado bajo nitrógeno liquido, por ejemplo, las características mas importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes /hojas muertas), numero de brotes verdes (para micropropagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.

3.5.1.1 REGENERACION

La regeneración de plantas enteras basada en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemas preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, que el proceso ofrece altas tasa de multiplicación y produce propagulos que poseen ejes de raíz y de yema (Stamp y henshaw, 1987). Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos mas estables (Evans et al., 1981). 

3.5.1 ASPECTOS IMPORTANTES EN LA CONSERVACION IN VITRO

Para algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semilla durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian complementarios para la conservación de genotipos específicos (cultivares, híbridos, clones elite) y para el traslado internacional de clones. Para otros cultivos de tubérculos y raíces tropicales y para especies de frutales como musa sp., que rara vez producen semilla y son practica mente estériles, el almacenamiento in vitro y los bancos genéticos ex situ en el campo estarían probablemente a la par. Por  ultimo, en las especies especies tropicales de semilla recalcitrante, la colección y el intercambio de materiales in vitro tendrán una función básica.

3.5 CONSERVACION IN VITRO

La conservación in vitro tiene que considerarse como parte dela estrategia general de conservación de una especie vegetal; es mas bien un auxiliar valioso y un suplemento de la conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro seria la única estrategia para conservar una especie dada.

3.4.3 FUSION DE PROTOPLASTOS

Celula vegetal deprovista de pared celular, por proceso mecanico o enzimatico, menbrana completamente expuesta, estado transitorio, permite manipulacion de esas celulas. 

3.4.2 VARIACIÓN SOMACLONAL

Esta plenamente comprobado que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981).

A diferencia de otros procesos de variación genética, se ha encontrado variación somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurre4ncia de mutaciones espontaneas, p. ej., es solo de una en un millón.

La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de mosaicos es mínima. En la mayor parte de los casos, por tanto, los somaclones pueden estabilizarse en una generación; las mutaciones, en cambio, requieren varias generaciones y retrocruces. La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos; los cambios genéticos que interfieren con la regeneración de las plantas-por ejemplo, un bloqueo en el metabolismo primario – no pasan por variación somaclonal a las plantas regeneradas.

La variación somaclonal puede causar una variación temporal (epigenetica) o una variación  genética. Por definición, los cambios epigeneticos no se trasmiten meioticamente, razón por la cual son útiles en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento si proviene de una verdadera modificación del material genético, ya que una variación celular puede provenir bien de una mutación, de un cambio epigenetico o de una combinación de ambos procesos (Meins, 1983).

Causas y manifestaciones.

Un buen número de revisiones recientes sobre la variación somaclonal han tratado aspectos de este tema como su ubicuidad, sus posibles causas, y su impacto potencial en el mejoramiento vegetal (Orton, 1984; Evans et al., 1984; Larkin et al). Es necesario entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genética durante el cultivo de tejidos, por razones de orden práctico. En primer lugar, la variación somaclonal es deseable para aumentar la ocurrencia de variabilidad en el mejoramiento de plantas; es además importante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos sea esencial, como en la micropropagacion rápida; es importante, en tercer lugar, para controlar el mecanismo que genera esa misma variación.

El origen de la variación no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. Puede ser, por ejemplo, un reordenamiento cromosómico, considerado el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse a un entrecruce (crossing over) somático, a un intercambio de cromatidas hermanas, a una alteración de los nucleótidos por metilación, a una perturbación de la replicación del ADN por culpa de un deposito de nucleótidos alterados, o también al silenciamiento o activación de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas.

En varias especies cultivadas se ha detectado variación somaclonal, y se ha demostrado el control genético de las mutaciones – mediante pruebas de trasmisión genética o análisis de ADN – solo en las siguientes: en tomate (color del fruto, resistencia a las enfermedades), en tabaco (color de la hoja, manchas en la hoja), en alfalfa (color de la flor), en papa (numero de copias del ADN mitocondrial), en trigo (patrón de la izoenzima ADH), y en arroz.

3.4 TECNICAS IN VITRO APLICADAS AL FITOMEJORAMIENTO

3.4.1  PRODUCCIÓN DE HAPLOIDES : CULTIVO DE ANTERAS Y ÓVULOS. 

Las metodologías disponibles para obtener cantidades considerables de haploides duplicados permitirán que el fitomejorador fije sistemas genéticos de gametos individuales, que sean reducidos y fáciles de evaluar en cualquier etapa del proceso de mejoramiento; se obtendrán así líneas homocigóticas sin pasar por el proceso de endogamia normal.

Los métodos mas ampliamente usados para la creación de haploides y de haploides duplicados se valen de la hibridación interespecifica o intergenerica, y del cultivo de esporas (masculinas o femeninas).

Los granos de polen de la papa silvestre (solanum phureja), p. ej. Contienen solo un núcleo generativo causado por una gametogénesis anormal; después de la hibridación interespecifica, con S. tuberosum como hembra, la fertilización doble no logra producirse, pero la célula del huevo de S. tuberosum es inducida a formar embriones partenogenicamente, y para ello estos serán haploides. Esta vía puede seguirse también en otras especies poliploides.

Diversas rutas hacia la obtención de la haploidia en plantas superiores, y su relación con la alteración de generaciones gametofiticas y esporofiticas. Los principales métodos para la obtención de heterofitos haploides emplean técnicas in vitro, como la androgénesis y la ginegenesis; otros procesos recurren a la partenogénesis y a la eliminación de cromosomas después de la hibridación interespecifica o intergenerica.

Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas haploides estériles pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta.

CONDICIONES QUE AFECTAN EL CULTIVO DE ANTERAS.

Genotipo de las plantas donantes.

El genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. Lam variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras se ha hallado entre especies y dentro de ellas, y se ha demostrado la heredabilidad de esta respuesta (Wenzel y Uhrig, 1981). Dicha capacidad para el cultivo de anteras es particularmente evidente en cultivares de arroz de los tipos Japónica e Indica de los cuales el primero es mas sensible que el ultimo así mismo, los genotipos invernales de B.napus dan una respuesta mas fuerte a ese cultivo que los tipos de primavera (Keller et al., 1987).

Además de la capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de plantitas (Wenzel et al., 1985; Lazar et al., 1984). Se demostró que ambos rasgos eran altamente heredables, lo que sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la selección.

Albinismo: Otro factor importante, especialmente en los cereales, es la ocurrencia de plantas albinas procedentes de polen. Estas plantas representan el 100% de algunas variedades de arroz; a menudo, pero no siempre, las variedades de arroz intensamente albinas se caracterizan también por una alta regeneración de la planta total (verdes más albinas). Sin embargo, esta correlación no vale para los híbridos.

Pretratamiento de las anteras.

El tratamiento de las anteras con temperatura baja o alta, con choque osmótico, o con otros estímulos tiende a aumentar la producción de plantitas de polen. El tratamiento de las anteras, o de las panículas, de arroz con 35 C durante 10 a 15 minutos, seguido por un periodo de 8 días a 10 C, aumenta la respuesta al cultivo de anteras; un efecto similar, no obstante, se obtiene con un tratamiento de 10 C durante 8 días solamente. El tratamiento de frio se ha relacionado con una disminución en el albinismo de los cereales, así como con la estimulación de la división mitótica ecuacional de las microesporas androgeneticas (Ouyang, 1986).

3.3.7 APLICACIÓN AGRONOMICA

Las ventajas y aplicaciones en la agronomia pùeden ser estas: 

• Plantas libres de virus
• intercambio y almacenamiento de germoplasma
• transferencias de genes 
• cultivos de importacia economica

3.3.6 FACTORES QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA POSIBILIDAD DE OBTENER PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS

Hay varios factores que influyen en la obtención de plantas sanas por MICROINJERTO: 

El tipo de patógeno es muy importante. Las bacterias endógenas, fitoplasmas y micoplasmas son muy fáciles de eliminar, debido a que su gran tamaño relativo hace difícil que puedan infectar las células de los ápices. La eliminación de virus y viroides es más difícil, pero existe una gran variabilidad en los resultados. Algunos son muy fáciles de eliminar y prácticamente el 100% de las plantas obtenidas están sanas, pero otros son muy difíciles y sólo se eliminan de un pequeño porcentaje de las plantas obtenidas. Probablemente estas diferencias están relacionadas con la mayor o menor facilidad de estos patógenos de moverse de célula a célula en los tejidos del huésped. Este factor es también probablemente responsable de que un mismo patógeno sea más fácil de eliminar en unos clones que en otros de una misma especie.

Las c o n d i c i o n e s óptimas de cultivo que favorezcan la formación de brotes vigorosos favorecen la eliminación de patógenos. La temperatura de cultivo de las plantas es muy importante. El cultivo de las plantas infectadas a temperaturas altas dificulta la replicación y movimiento de los patógenos termosensibles, por lo que se facilita su eliminación. Temperaturas de 30-32∞C durante 2-3 semanas pueden ser suficientes para incrementar de forma muy importante la incidencia de eliminación de algunos patógenos, e incluso tratamientos de termoterapia seguidos de cultivo o microinjerto de ápices se utilizan rutinariamente en algunos programas.

El tamaño del ápice juega un papel importante en la eliminación de pató-genos. El aumento de tamaño incrementa el porcentaje de regeneración y de prendimiento, pero reduce la proporción de plantas sanas obtenidas. En consecuencia, es necesario en cada caso adoptar una solución de compromiso que permita obtener unos resultados aceptables en ambos parámetros El costo, el tiempo requerido y la dificultad de las técnicas de cultivo  in vitro y de diagnóstico de patógenos son los aspectos que deben considerarse para la decisión del tamaño de ápice a utilizar en los programas rutinarios. Por ejemplo, para el saneamiento de cítricos por microinjerto se recomienda la utilización de un ápice compuesto por el meristemo apical y tres primordios foliares, con una longitud de 0'1 a 0'2 mm. Con este tamaño se puede obtener alrededor de un 50% de prendimiento y más del 90% de eliminación de patógenos.

3.3.5 MICROINJERTO

Es una tecnica utilizada en ensayos de revigorizacion, orientados principalmente a la clonacion de materiales adultos seleccionados libres de contaminacion. El material vegetal adulto es propagado vegetativamente in vitro, cultivado en un medio MS con reguladores de crecimiento. 

Para la preparacion del patron se siembra en tubos de ensayo con medio de germinacion compuesta por sales minerales salificando el agar, donde permanece en oscuridad constante a 27 - 30 º C durante alrededor de dos semanas hasta q las plantulas alcansen su desarrollo optimo para su microinjerto. 

Para la propagación del injerto es recomendable utilizar injertos menores de 5 cm para evitar su degradacion. a este se le realiza la esterilizacion en hipoclorito de sodio y twen durante cinco minutos.

3.3.4 CULTIVO DE EMBRIONES

 El cultivo de embriones ha ayudado al mejoramiento genético de especies arbóreas por que acorta el periodo siembra-floración; los embriones cultivados in vitro no necesitan un periodo de latencia anterior a la germinación. Asimismo, ha sido efectico para acortar el ciclo de mejoramiento de Iris spp., por que acorta el periodo de latencia de las semillas que oscila entre unos pocos meses y varios años; esta latencia se debe a algunos inhibidores del crecimiento del embrión presentes en el endospermo y en la cubierta de la semilla. Por medio del cultivo de embriones, es posible acortar la latencia y producir plántulas para el trasplante a las 2 o 3 semanas.

FACTORES QUE AFECTA EL CULTIVO

1.  Medio de cultivo. Por ejemplo, la concentración optima de sacarosa para el crecimiento de embriones en forma de corazón es de 120 g/litro, los niveles altos de sacarosa previenen la germinación precoz y proveen una fuente de carbohidratos mejor que otros azucares.

• 
  
•  Osmolaridad. El medio de cultivo, que contiene una concentración alta de sacarosa, está ubicada en el centro del recipiente de cultivo y rodeada a su vez de otro medio que contiene una concentración más baja de sacarosa. Después de un tiempo, la osmolaridad en la parte central del recipiente de cultivo se reduce debido a la difusión de agua desde el medio que lo rodea.

3.3.3 CULTIVO DE APICES MERISTEMATICO

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados vegetativamente, contiene virus sistemáticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarias otros métodos.

3.3.2 CULTIVO DE MERISTEMOS APICALES

El meristemo apical (con un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas

El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes, es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de enorme potencial: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4 millones de claveles en un año.

La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.  

Fases del cultivo de meristemos

1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

2. Siembra en el medio del tubo.

3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.

4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).

5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc..

6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.

7. Plantación en el campo.

3.3.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA

Actualmente la alternativa de más éxito es el cultivo de meristemas apicales, frecuentemente combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos métodos son usados, las plantas no solo son liberadas del virus,sino también de hongos y otros patógenos.

El primer cultivo con resultados satisfactorios fue el de Morel y Martín (1952), quienes cultivaron ápices de dalias infectadas con virus y lograron obtener plantas sana. Morel (1955) realizó un cultivo meristemático con Cymbidium, Cattleya y Phajus, obteniendo orquídeas libres de virus, y en 1960 reporta que es necesario hacer ciertas modificaciones en el medio, ya que géneros como Vlanda y Phalaenosis no responden favorablemente (citado por Lecoufle, 1969).

Existen otras investigaciones en plantas ornamentales, pero solo se han mencionado las más importantes, por los aportes que han brindado en este campo.

En cuanto a especies hortícolas y frutales se han realizado importantes investigaciones en relación con la obtención de material sano a partir de meristemos apicales; los más relevantes fueron hechos en papa (Sussex, 1963; Ingram y Robertson, 1965; Accatino, 1966; Gregorini y Lorenzi, 1964; Mellor y Stace – Smith, 1977; Wang, 1977 y Solórzano, 1983), chile (Juo, Wahg y Chien, 1973), fresa (Belkengren y Muller, 1962), manzano (Elliott 1972; Jones, 1976; Aboot, 1976; Jones y Hopgood, 1979), vid (Barlass y Skene, 1978), etc.

4. Termoterapia.

Consiste en la aplicación de altas temperaturas a las plantas completas o partes aisladas:

Algunos virus son más estables que otros, y esto causa diversos problemas en su erradicación, por lo que necesitan periodos más largos para unos y más cortos para otros, con diferentes tratamientos. Algunas especies son dañadas por las altas temperaturas continuas, por lo que se recomienda una alternancia de temperaturas altas y bajas, disminuyéndose así los daños causados en los tejidos de las plantas.

5. Quimioterapia.

Es la aplicación de productos químicos al medio de cultivo, lo que ocasiona una mayor probabilidad de obtener plantas de patógenos, por lo que al aplicarse diferentes productos quimioterapéuticos de manera exógena al medio de cultivo, estamos asegurando la obtención de material sano.

En el cultivo de ápices de papa (Solanum tuberosum L.) se aplicó verde de malaquita como agente quimioterapéutico, observándose en los resultados un mayor número de plantas libres de virus "X" (Norris, 1954; Oshima y Livingstone, 1961) obtuvo resultados semejantes al incluir en el medio 2, 4 – D, obteniendo una mayor frecuencia de plantas sanas.

Johnstone y Wade (1974) sugieren que al aplicar altas concentraciones de citoquininas y auxinas estás actúan favoreciendo o estimulando el crecimiento activo del hospedero, pero no el de la partícula viral. No hay muchas evidencias al respecto, pero se dice que los reguladores del crecimiento reducen la concentración del virus pero no lo erradican (Gohen y Walkey, 1978).

Estudios quimioterapéuticos más recientes sugieren que incorporando al medio de cultivo metabolitos químicos como el Kibavirin (virazole), que es un producto antiviral, se puede erradicar el virus (Mough, 1976).

Combinando la quimioterapia con el cultivo de meristemos de tabaco infectado con virus "X" de la papa se logró una erradicación total del mismo (Sherpard, 1977); más recientemente ha sido incorporado el vizarole aa concentraciones de 50 y 100 mg/l, encontrándose que erradicó el CMV de tejido meristemático de Nicotiana rustica.

Como se puede observar, los avances obtenidos en la técnica de cultivo de meristemos, auxiliada con la aplicación de termoterapia y quimioterapia, ha tenido grandes logros en cuento a la aplicación de las técnicas a diferentes especies.

Cabe mencionar que en los países desarrollados, en los últimos años, se han establecido compañías que se dedican a propagar de una manera comercial diferentes especies, que incluyen hortalizas, cultivos básicos, frutales, especies forestales, plantas medicinales, etc.

En la página siguiente se muestra un esquema representativo de cómo se debe llevar a cabo un programa de producción de plantas libres de virus a nivel comercial.

3.3 PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados vegetativamente, contiene virus sistemáticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarias otros métodos.

3.2.4 APLICACION AGRONOMICA

Las ventajas de este método es que permite obtener muchos individuos iguales en una pequeña superficie, controlar las condiciones ambientales, estudiar diversos procesos de las plantas y evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados). Constituye uno de los métodos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

También se utilizan para:

• micro propagación en gran escala
• fito sanidad
• metabolismos secundarios
• mejoramiento. 

3.2.3 RUTAS: ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA

ORGANOGENESIS: creación de órganos vegetales in vitro: raíces, tallos, hojas, meristemos, flores, microtuberculizacion. ( división multicelular) puede ser directa o indirecta. 

DIRECTA: se generan órganos directamente sobre el explante. 

INDIRECTA: el ex plante pasa por una etapa intermedia llamada callo y despues se forman los órganos. 

EMBRIOGENESIS: es la formación de embriones (somáticos) sin que aya unión de gametos. ( ovulo y polen). origen en una sola célula. el embrion es bipolar ( forma raíces y tallos). 

DIRECTA: cuando se forman embriones directamente.

INDIRECTA: se forman después de un callo ( es la mas común). despues de la formacion del callo embriogenico.